1 место микробиологии и иммунологии в современной медици­не. роль микробиологии и иммунологии в подготовке вра






Конъюгация бактерий состоит в переходе генети­ческого материала (ДНК) из клетки-донора («мужской») в клет­ку-реципиент («женскую») при контакте клеток между собой.

Мужская клетка содержит F-фактор, или половой фактор, который контролирует синтез так называемых половых пилей, или F-пилей. Клетки, не содержа­щие F-фактора, являются женскими; при получении F-фактора они превращаются в «мужские» и сами становятся донорами. F-фактор располагается в цитоплазме в виде кольцевой двунитчатой молекулы ДНК, т. е. является плазмидой. Молекула F-фак­тора значительно меньше хромосомы и содержит гены, контро­лирующие процесс конъюгации, в том числе синтез F-пилей. При конъюгации F-пили соединяют «мужскую» и «женскую» клетки, обеспечивая переход ДНК через конъюгационный мостик или F-пили. Клетки, содержащие F-фактор в цитоплазме, обозначаются F+; они передают F-фактор клеткам, обозначае­мым F" («женским»), не утрачивая донорской способности, так как оставляют копии F-фактора. Если F-фактор включается в хромосому, то бактерии приобретают способность передавать фрагменты хромосомной ДНК и называются Hfr-клетками (от англ. high frequency of recombination — высокая частота реком­бинаций), т.е. бактериями с высокой частотой рекомбинаций. При конъюгации клеток Hfr и клеток F" хромосома разрывается и передается с определенного участка (начальной точки) в клет­ку F", продолжая реплицироваться. Перенос всей хромосомы может длиться до 100 мин.

Переносимая ДНК взаимодействует с ДНК реципиента — происходит гомологичная рекомбинация. Прерывая процесс конъ­югации бактерий, можно определять последовательность распо­ложения генов в хромосоме. Иногда F-фактор может при выхо­де из хромосомы захватывать небольшую ее часть, образуя так называемый замещенный фактор — F'.

При конъюгации происходит только частичный перенос ге­нетического материала, поэтому ее не следует отождествлять пол­ностью с половым процессом у других организмов.

Трансдукция — передача ДНК от бактерии-донора к бактерии-реципиенту при участии бактериофага. Различают неспецифическую (общую) трансдукцию, при которой возможен перенос любого фрагмен­та ДНК донора, и специфическую — перенос определен­ного фрагмента ДНК донора только в определенные участки ДНК реципиента. Неспецифическая трансдукция обусловлена включе­нием ДНК донора в головку фага дополнительно к геному фага или вместо генома фага (дефектные фаги). Специфическая транс­дукция обусловлена замещением некоторых генов фага генами хромосомы клетки-донора. Фаговая ДНК, несущая фрагменты хромосомы клетки-донора, включается в строго определенные участки хромосомы клетки-реципиента. Таким образом, привно­сятся новые гены и ДНК фага в виде профага репродуцируется вместе с хромосомой, т.е. этот процесс сопровождается лизоге-нией. Если фрагмент ДНК, переносимый фагом, не вступает в рекомбинацию с хромосомой реципиента и не реплицируется, но с него считывается информация о синтезе соответствующего про­дукта, такая трансдукция называется абортивной.

Трансформация заключа­ется в том, что ДНК, выделенная из бактерий в свободной ра­створимой форме, передается бактерии-реципиенту. При транс­формации рекомбинация происходит, если ДНК бактерий род­ственны друг другу. В этом случае возможен обмен гомологич­ных участков собственной и проникшей извне ДНК. Впервые явление трансформации описал Ф. Гриффите (1928). Он вводил мышам живой невирулентный бескапсульный R-штамм пневмо­кокка и одновременно убитый вирулентный капсульный S-штамм пневмококка. Из крови погибших мышей был выделен вирулен­тный пневмококк, имеющий капсулу убитого S-штамма пнев­мококка. Таким образом, убитый S-штамм пневмококка передал наследственную способность капсулообразования R-штамму пнев­мококка. О. Эвери, К. Мак-Леод и М. Мак-Карти (1944) дока­зали, что трансформирующим агентом в этом случае является ДНК. Путем трансформации могут быть перенесены различные признаки: капсулообразование, устойчивость к антибиотикам, синтез ферментов.

Изучение бактериальной трансформации позволило установить роль ДНК как материального субстрата наследственности. При изучении генетической трансформации у бактерий были разра­ботаны методы экстракции и очистки ДНК, биохимические и биофизические методы ее анализа.


38 Плазмиды бактерий, их функции и свойства. Использова­ние плазмид в генной инженерии.


Плазмиды — внехромосомные мобильные генетические структуры бактерий, представляющие собой замкнутые кольца двунитчатой ДНК. По размерам составляют 0,1—5 % ДНК хромосомы. Плаз­миды способны автономно копироваться (реплицироваться) и существовать в цитоплазме клетки, поэтому в клетке может быть несколько копий плазмид. Плазмиды могут включаться (интег­рировать) в хромосому и реплицироваться вместе с ней. Разли­чают трансмиссивные и нетрансмиссивные плазмиды. Трансмиссив­ные (конъюгативные) плазмиды могут передаваться из одной бактерии в другую.

^ Среди фенотипических признаков, сооб­щаемых бактериальной клетке плазмидами, можно выделить следующие:

1) устойчивость к антибиотикам;

2) образование колицинов;

3) продукция факторов патогенности;

4) способность к синтезу антибиотических веществ;

5) расщепление сложных органических ве­ществ;

6) образование ферментов рестрикции и модификации.

Термин «плазмиды» впервые введен американским ученым Дж. Ледербергом (1952) для обозначения полового фактора бак­терий. Плазмиды несут гены, не обязательные для клетки-хозя­ина, придают бактериям дополнительные свойства, которые в определенных условиях окружающей среды обеспечивают их вре­менные преимущества по сравнению с бесплазмидными бакте­риями.

^ Некоторые плазмиды находятся под стро­гим контролем. Это означает, что их реплика­ция сопряжена с репликацией хромосомы так, что в каждой бактериальной клетке присутс­твует одна или, по крайней мере, несколько копий плазмид.

Число копий плазмид, находящихся под слабым контролем, может достигать от 10 до 200 на бактериальную клетку.

Для характеристики плазмидных реплико-нов их принято разбивать на группы совмести­мости. Несовместимость плазмид связана с не­способностью двух плазмид стабильно сохра­няться в одной и той же бактериальной клетке. Несовместимость свойственна тем плазмидам, которые обладают высоким сходством репликонов, поддержание которых в клетке регули­руется одним и тем же механизмом.

Некоторые плазмиды могут обратимо встраиваться в бактериальную хромосому и функционировать в виде единого репликона. Такие плазмиды называются интегративными или эписомами.

У бактерий различных видов обнаружены R-плазмиды, несу­щие гены, ответственные за множественную устойчивость к лекарственным препаратам — антибиотикам, сульфаниламидам и др., F-плазмиды, или половой фактор бактерий, определяющий их способность к конъюгации и образованию половых пилей, Ent-плазмиды, детерминирующие продукцию энтеротоксина.

Плазмиды могут определять вирулентность бактерий, напри­мер возбудителей чумы, столбняка, способность почвенных бак­терий использовать необычные источники углерода, контроли­ровать синтез белковых антибиотикоподобных веществ — бактериоцинов, детерминируемых плазмидами бактериоциногении, и т. д. Существование множества других плазмид у микроорганиз­мов позволяет полагать, что аналогичные структуры широко рас­пространены у самых разнообразных микроорганизмов.

Плазмиды подвержены рекомбинациям, мутациям, могут быть элиминированы (удалены) из бактерий, что, однако, не влияет на их основные свойства. Плазмиды являются удобной моделью для экспериментов по искусственной реконструкции генетичес­кого материала, широко используются в генетической инжене­рии для получения рекомбинантных штаммов. Бла­годаря быстрому самокопированию и возможности конъюгаци-онной передачи плазмид внутри вида, между видами или даже родами плазмиды играют важную роль в эволюции бактерий.


39 Медицинская биотехнология, ее задачи и достижения.


Биотехнология представляет собой область знаний, которая воз­никла и оформилась на стыке микробиологии, молекулярной биологии, генетической инженерии, химической технологии и ряда других наук. Рождение биотехнологии обусловлено потреб­ностями общества в новых, более дешевых продуктах для на­родного хозяйства, в том числе медицины и ветеринарии, а также в принципиально новых технологиях. Биотехнология — это получение продуктов из био­логических объектов или с применением биологических объек­тов. В качестве биологических объектов могут быть использова­ны организмы животных и человека (например, получение им­муноглобулинов из сывороток вакцинированных лошадей или людей; получение препаратов крови доноров), отдельные орга­ны (получение гормона инсулина из поджелудочных желез круп­ного рогатого скота и свиней) или культуры тканей (получение лекарственных препаратов). Однако в качестве биологических объектов чаще всего используют одноклеточные микроорганиз­мы, а также животные и растительные клетки.

^ Клетки животных и растений, микробные клетки в процессе жизнедеятельности (ассимиляции и диссимиляции) образуют но­вые продукты и выделяют метаболиты, обладающие разнообраз­ными физико-химическими свойствами и биологическим дей­ствием.

^ Биотехнология использует эту продукцию клеток как сырье, которое в результате технологической обработки превращается в конечный продукт. С помощью биотехнологии получают мно­жество продуктов, используемых в различных отраслях:

• медицине (антибиотики, витамины, ферменты, аминокисло­ты, гормоны, вакцины, антитела, компоненты крови, диаг­ностические препараты, иммуномодуляторы, алкалоиды, пи­щевые белки, нуклеиновые кислоты, нуклеозиды, нуклеоти-ды, липиды, антиметаболиты, антиоксиданты, противоглис­тные и противоопухолевые препараты);

• ветеринарии и сельском хозяйстве (кормовой белок: кормо­вые антибиотики, витамины, гормоны, вакцины, биологичес­кие средства защиты растений, инсектициды);

• пищевой промышленности (аминокислоты, органические кис­лоты, пищевые белки, ферменты, липиды, сахара, спирты, дрожжи);

• химической промышленности (ацетон, этилен, бутанол);

• энергетике (биогаз, этанол).

^ Следовательно, биотехнология направлена на создание диаг­ностических, профилактических и лечебных медицинских и ве­теринарных препаратов, на решение продовольственных вопро­сов (повышение урожайности, продуктивности животноводства, улучшение качества пищевых продуктов — молочных, кондитер­ских, хлебобулочных, мясных, рыбных); на обеспечение мно­гих технологических процессов в легкой, химической и других отраслях промышленности. Необходимо отметить также все воз­растающую роль биотехнологии в экологии, так как очистка сточных вод, переработка отходов и побочных продуктов, их деградация (фенол, нефтепродукты и другие вредные для окру­жающей среды вещества) осуществляются с помощью микро­организмов.

В настоящее время в биотехнологии выделяют медико-фарма­цевтическое, продовольственное, сельскохозяйственное и эколо­гическое направления. В соответствии с этим биотехнологию можно разделить на медицинскую, сельскохозяйственную, про­мышленную и экологическую. Медицинская в свою очередь под­разделяется на фармацевтическую и иммунобиологическую, сель­скохозяйственная — на ветеринарную и биотехнологию расте­ний, а промышленная — на соответствующие отраслевые направ­ления (пищевая, легкая промышленность, энергетика и т. д.).

Биотехнологию также подразделяют на традиционную (ста­рую) и новую. Последнюю связывают с генетической инжене­рией. Общепризнанное определение предмета «биотехнология» от­сутствует и даже ведется дискуссия о том, наука это или про­изводство.


40 Молекулярно-биологические методы, используемые в диа­гностике инфекционных болезней (ПЦР, рестрикционный анализ и др.).


Полимеразная цепная реакция позволяет обнаружить микроб в ис­следуемом материале (воде, продуктах, ма­териале от больного) по наличию в нем ДНК микроба без выделения последнего в чистую культуру.

Для проведения этой реакции из исследу­емого материала выделяют ДНК, в которой определяют наличие специфичного для дан­ного микроба гена. Обнаружение гена осу­ществляют его накоплением. Для этого необ­ходимо иметь праймеры комплементарного З'-концам ДНК. исходного гена. Накопление (амплификация) гена выполняется следую­щим образом. Выделенную из исследуемого материала ДНК нагревают. При этом ДНК распадается на 2 нити. Добавляют праймеры. Смесь ДНК и праймеров охлаждают. При этом праймеры, при наличии в смеси ДНК искомо­го гена, связываются с его комплементарными участками. Затем к смеси ДНК и праймера добавляют ДНК-полимеразу и нуклеотиды. Устанавливают температуру, оптимальную для функционирования ДНК-полимеразы. В этих условиях, в случае комплементарное™ ДНК гена и праймера, происходит присоединение нуклеотидов к З'-концам праймеров, в резуль­тате чего синтезируются две копии гена. После этого цикл повторяется снова, при этом ко­личество ДНК гена будет увеличиваться каждый раз вдвое. Проводят реакцию в специальных приборах — амплификаторах. ПЦР применяется для диагностики вирусных и бактериальных инфекций.

^ Рестрикционный анализ. Данный метод основан на применении фер­ментов, носящих название рестриктаз. Рестриктазы представляют собой эндонук-леазы, которые расщепляют молекулы ДНК, разрывая фосфатные связи не в произвольных местах, а в определенных последовательностях нуклеотидов. Особое значение для методов мо­лекулярной генетики имеют рестриктазы, кото­рые узнают последовательности, обладающие центральной симметрией и считывающиеся одинаково в обе стороны от оси симметрии. Точка разрыва ДНК может или совпадать с осью симметрии, или быть сдвинута относи­тельно нее.

В настоящее время из различных бактерий выделено и очищено более 175 различных рестриктаз, для которых известны сайты (участки) узнавания (рестрикции). Выявлено более 80 различных типов сайтов, в которых может про­исходить разрыв двойной спирали ДНК.

В геноме конкретной таксономической еди­ницы находится строго определенное (генети­чески задетерминированное) число участков узнавания для определенной рестриктазы.

Если выделенную из конкретного микроба ДНК обработать определенной рестриктазой, то это приведет к образованию строго опреде­ленного количества фрагментов ДНК фикси­рованного размера.

Размер каждого типа фрагментов можно узнать с помощью электрофореза в агарозном геле: мелкие фрагменты перемещаются в геле быстрее, чем более крупные фрагменты, и длина их пробега больше. Гель окрашива­ют бромистым этидием и фотографируют в УФ-излучении. Таким образом можно полу­чить рестрикционную карту определенного вида микробов.

Сопоставляя карты рестрикции ДНК, вы­деленных из различных штаммов, можно оп­ределить их генетическое родство, выявить принадлежность к определенному виду или роду, а также обнаружить участки, подвергну­тые мутациям.

Этот метод используется также как началь­ный этап метода определения последователь­ности нуклеотидных пар (секвенирования) и метода молекулярной гибридизации.

^ Метод молекулярной гибридизации позволяет выявить степень сходства раз­личных ДНК. Применяется при идентифи­кации микробов для определения их точного таксономического положения.

Метод основан на способности двухцепочечной ДНК при повышенной температуре (90 °С) в щелочной среде денатурировать, т. е. расплетаться на две нити, а при понижении температуры на 10 °С вновь восстанавливать исходную двухцепочечную структуру. Метод требует наличия молекулярного зонда.

Зондом называется одноцепочечная мо­лекула нуклеиновой кислоты, меченная ра­диоактивными нуклидами, с которой сравнивают исследуемую ДНК.

Для проведения молекулярной гибридизации исследуемую ДНК расплетают указанным выше способом, одну нить фиксируют на специальном фильтре, который затем помещают в раствор, со­держащий радиоактивный зонд. Создаются ус­ловия, благоприятные для образования двойных спиралей. В случае наличия комплементарности между зондом и исследуемой ДНК, они образу­ют между собой двойную спираль.

^ Риботипирование и опосредованная транскрипцией амплификация рибосомальной РНК. Последовательность нуклеотидных основа­ний в оперонах, кодирующих рРНК, отлича­ется консервативностью, присущей каждомувиду бактерий. Эти опероны представлены на бактериальной хромосоме в нескольких ко­пиях. Фрагменты ДНК, полученные после об­работки ее рестриктазами, содержат последо­вательности генов рРНК, которые могут быть обнаружены методом молекулярной гибри­дизации с меченой рРНК соответствующего виды бактерий. Количество и локализация копий оперонов рРНК и рестрикционный состав сайтов как внутри рРНК-оперона, так и по его флангам варьируют у различных вида бактерий. На основе этого свойства построен метод риботипирования, который позволяет производить мониторинг выделенных штам­мов и определение их вида. В настоящее вре­мя риботипирование проводится в автомати­ческом режиме в специальных приборах.

Опосредованная транскрипцией амплифика­ция рРНК используется для диагностики сме­шанных инфекций. Этот метод основан на обнаружении с помощью молекулярной гиб­ридизации амплифицированных рРНК, спе­цифичных для определенного вида бактерий. Исследование проводится в три этапа:

1. Амплификация пула рРНК на матрице вы­деленной из исследуемого материала ДНК при помощи ДНК-зависимой РНК-полимеразы.

2. Гибридизация накопленного пула рРНК с комплементарными видоспецифическим рРНК олигонуклеотидами, меченными флюорохромом или ферментами.

3. Определение продуктов гибридизации методами денситометрии, иммунофермент-ного анализа (ИФА).

Реакция проводится в автоматическом ре­жиме в установках, в которых одномоментное определение рРНК, принадлежащих различ­ным видам бактерий, достигается разделе­нием амплифицированного пула рРНК на несколько проб, в которые вносятся компле­ментарные видоспецифическим рРНК мече­ные олигонуклеотиды для гибридизации.


41 Понятие о химиотерапии. История открытия химиопрепаратов.


Химиотерапия — специфическое антимикробное, антипаразитар­ное лечение при помощи химических веществ. Эти вещества обла­дают важнейшим свойством — избирательностью действия против болезнетворных микроорганизмов в условиях макроорганизма.

^ Основоположником химиотерапии является немецкий химик, лауреат Нобелевской премии П.Эрлих, который установил, что химические вещества, содержащие мышьяк, губительно действу­ют на спирохеты и трипаносомы, и получил в 1910 г. первый химиотерапевтический препарат — сальварсан (соединение мы­шьяка, убивающее возбудителя, но безвредное для микроорга­низма).

В 1935 г. другой немецкий химик Г.Домагк обнаружил среди анилиновых красителей вещество — пронтозил, или красный стрептоцид, спасавший экспериментальных животных от стрепто­кокковой инфекции, но не действующий на эти бактерии вне организма. За это открытие Г.Домагк был удостоен Нобелевс­кой премии. Позднее было выяснено, что в организме происхо­дит распад пронтозила с образованием сульфаниламида, обла­дающего антибактериальной активностью как in vivo, так и in vitro.

Механизм действия сульфаниламидов (сульфонамидов) на микроорганизмы был открыт Р.Вудсом, установившим, что суль­фаниламиды являются структурными аналогами парааминобензойной кислоты (ПАБК), участвующей в биосинтезе фолиевой кислоты, необходимой для жизнедеятельности бактерий. Бакте­рии, используя сульфаниламид вместо ПАБК, погибают.

^ Первый природный антибиотик был открыт в 1929 г. англий­ским бактериологом А.Флемингом. При изучении плесневого гри­ба Penicillium notatum, препятствующего росту бактериальной культуры, А. Флеминг обнаружил вещество, задерживающее рост бактерий, и назвал его пенициллином. В 1940 г. Г. Флори и Э. Чейн получили очищенный пенициллин. В 1945 г. А Флеминг, Г. Флори и Э. Чейн стали Нобелевскими лауреатами.

В настоящее время имеется огромное количество химиотерапевтических препаратов, которые применяются для лечения за­болеваний, вызванных различными микроорганизмами.


42 Антибиотики. Природные и синтетические. История открытия природных антибиотиков. Классификация ан­тибиотиков по химической структуре, механизму, спект­ру и типу действия. Способы получения.


Антибиотики — химиотерапевтические вещества, продуцируемые микроорганизмами, животными клетками, растениями, а также их производные и синтетические продукты, которые обладают избирательной спо­собностью угнетать и задерживать рост микроорганизмов, а также подавлять развитие злокачественных новообразований.

За тот период, который прошел со времени открытия П.Эрлиха, было получено более 10 000 различных антибиотиков, по­этому важной проблемой являлась систематизация этих препа­ратов. В настоящее время существуют различные классификации антибиотиков, однако ни одна из них не является общеприня­той.

^ В основу главной классификации антибиотиков положено их химическое строение.



Наиболее важными классами синтетических антибиотиков яв­ляются хинолоны и фторхинолоны (например, ципрофлоксацин), сульфаниламиды (сульфадиметоксин), имидазолы (метронидазол), нитрофураны (фурадонин, фурагин).

^ По спектру действия антибиотики делят на пять групп в зави­симости от того, на какие микроорганизмы они оказывают воз­действие. Кроме того, существуют противоопухолевые антибио­тики, продуцентами которых также являются актиномицеты. Каж­дая из этих групп включает две подгруппы: антибиотики широ­кого и узкого спектра действия.

^ Антибактериальные антибиотики составляют самую многочисленную группу препаратов. Преобладают в ней антиби­отики широкого спектра действия, оказывающие влияние на представителей всех трех отделов бактерий. К антибиотикам широкого спектра действия относятся аминогликозиды, тетрациклины и др. Антибиотики узкого спектра действия эффектив­ны в отношении небольшого круга бактерий, например полет-миксины действуют на грациликутные, ванкомицин влияет на грамположительные бактерии.

^ В отдельные группы выделяют противотуберкулезные, противолепрозные, противосифилитические препараты.

Противогрибковые антибиотики включают значитель­но меньшее число препаратов. Широким спектром действия об­ладает, например, амфотерицин В, эффективный при кандидозах, бластомикозах, аспергиллезах; в то же время нистатин, дей­ствующий на грибы рода Candida, является антибиотиком узко­го спектра действия.

^ Антипротозойные и антивирусные антибиотики на­считывают небольшое число препаратов.

Противоопухолевые антибиотики представлены препара­тами, обладающими цитотоксическим действием. Большинство из них применяют при многих видах опухолей, например митоми-цин С.

Действие антибиотиков на микроорганизмы связано с их спо­собностью подавлять те или иные биохимические реакции, про­исходящие в микробной клетке.

^ В зависимости от механизма дей­ствия различают пять групп антибиотиков:

1. антибиотики, нарушающие синтез клеточной стенки. К этой группе относятся, например, -лактамы. Препараты этой груп­пы характеризуются самой высокой избирательностью дей­ствия: они убивают бактерии и не оказывают влияния на клет­ки микроорганизма, так как последние не имеют главного компонента клеточной стенки бактерий — пептидогликана. В связи с этим -лактамные антибиотики являются наименее токсичными для макроорганизма;

2. антибиотики, нарушающие молекулярную организацию и синтез клеточных мембран. Примерами подоб­ных препаратов являются полимиксины, полиены;

3. антибиотики, нарушающие синтез белка; это наиболее многочисленная группа препаратов. Представителями этой группы являются аминогликозиды, тетрациклины, макроли-ды, левомицетин, вызывающие нарушение синтеза белка на разных уровнях;

4. антибиотики — ингибиторы синтеза нуклеиновых кислот. Например, хинолоны нарушают синтез ДНК, рифампицин — синтез РНК;

5. антибиотики, подавляющие синтез пуринов и аминокислот. К этой группе относятся, например, сульфаниламиды.

^ Источники антибиотиков.

Основными продуцентами природных ан­тибиотиков являются микроорганизмы, ко­торые, находясь в своей естественной среде (в основном, в почве), синтезируют антибио­тики в качестве средства выживания в борьбе за существование. Животные и растительные клетки также могут вырабатывать некото­рые вещества с селективным антимикробным действием (например, фитонциды), однако широкого применения в медицине в качестве продуцентов антибиотиков они не получили.

Таким образом, основными источниками получения природных и полусинтетических антибиотиков стали:

• Актиномицеты (особенно стрептомицеты) — ветвящиеся бактерии. Они синтезиру­ют большинство природных антибиотиков (80 %).

• ^ Плесневые грибы — синтезируют природ­ные бета-лактамы (грибы рода Cephalosporium и Penicillium)H фузидиевую кислоту.

• Типичные бактерии — например, эубактерии, бациллы, псевдомонады — продуцируют бацитрацин, полимиксины и другие вещества, обладающие антибактериальным действием.

^ Способы получения.

Существует три основных способа получе­ния антибиотиков:

• биологический синтез (так получают при­родные антибиотики — натуральные продук­ты ферментации, когда в оптимальных ус­ловиях культивируют микробы-продуценты, которые выделяют антибиотики в процессе своей жизнедеятельности);

• биосинтез с последующими химическими модификациями (так создают полусинтетичес­кие антибиотики). Сначала путем биосинтеза получают природный антибиотик, а затем его первоначальную молекулу видоизменяют путем химических модификаций, например присо­единяют определенные радикалы, в результате чего улучшаются противомикробные и фарма­кологические характеристики препарата;

• химический синтез (так получают синте­тические аналоги природных антибиотиков, например хлорамфеникол/левомицетин). Это вещества, которые имеют такую же структуру,


43 Осложнения антибиотикотерапии, их предупреждение.


Как и всякие лекарственные средства, практически каждая группа антимикробных химиопрепаратов может оказывать побочное действие, причем и на макроорганизм, и на микробы, и на другие лекарственные средства.

Осложнения со стороны макроорганизма

Наиболее частыми осложнениями анти­микробной химиотерапии являются:

^ Токсическое действие препаратов. Как правило, развитие этого осложнения зависит от свойств самого препарата, его до­зы, способа введения, состояния больного и проявляется только при длительном и систе­матическом применении антимикробных химиотерапевтических препаратов, когда созда­ются условия для их накопления в организме. Особенно часто такие осложнения бывают, когда мишенью действия препарата являются процессы или структуры, близкие по составу или строению к аналогичным структурам кле­ток макроорганизма. Токсическому действию антимикробных препаратов особенно подвер­жены дети, беременные, а также пациенты с нарушением функций печени, почек.

Побочное токсическое влияние может прояв­ляться как нейротоксическое (например, гликопептиды и аминогликозиды оказывают ототоксическое действие, вплоть до полной потери слуха за счет воздействия на слуховой нерв); нефротоксическое (полиены, полипептиды, аминогликозиды, макролиды, гликопептиды, сульфаниламиды); общетоксическое (противо­грибковые препараты — полиены, имидазолы); угнетение кроветворения (тетрациклины, суль­фаниламиды, левомицетин/хлорамфеникол, который содержит нитробензен — супрессор функции костного мозга); тератогенное [ами­ногликозиды, тетрациклины нарушают развитие костей, хрящей у плода и детей, формирова­ние зубной эмали (коричневая окраска зубов), левомицетин/хлорамфеникол токсичен для но­ворожденных, у которых ферменты печени не полностью сформированы («синдром серого ребенка»), хинолоны — действуют на развива­ющуюся хрящевую и соединительную ткани].

Предупреждение осложнений состоит в от­казе от противопоказанных данному пациенту препаратов, контроле за состоянием функций печени, почек и т. п.

^ Дисбиоз (дисбактериоз). Антимикробные химиопрепараты, особен­но широкого спектра, могут воздействовать не только на возбудителей инфекций, но и на чувствительные микроорганизмы нормаль­ной микрофлоры. В результате формируется дисбиоз, поэтому нарушаются функции ЖКТ, возникает авитаминоз и может развиться вто­ричная инфекция (в том числе эндогенная, например кандидоз, псевдомембранозный ко­лит). Предупреждение последствий такого рода осложнений состоит в назначении, по возможности, препаратов узкого спектра действия, сочетании лечения основного заболевания с противогрибковой терапией (например, назначением нистатина), витаминотерапей, применением эубиотиков и т. п.

^ Отрицательное воздействие на иммунную систему. К этой группе осложнений отно­сят прежде всего аллергические реакции. Причинами развития гиперчувствительности может быть сам препарат, продукты его распа­да, а также комплекс препарата с сывороточ­ными белками. Возникновение такого рода осложнений зависит от свойств самого пре­парата, от способа и кратности его введения, индивидуальной чувствительности пациента к препарату. Аллергические реакции разви­ваются примерно в 10 % случаев и проявля­ются в виде сыпи, зуда, крапивницы, отека Квинке. Относительно редко встречается та­кая тяжелая форма проявления аллергии, как анафилактический шок. Такое осложнение чаще дают бета-лактамы (пенициллины), рифамицины. Сульфаниламиды могут вызвать гиперчувствительность замедленного типа. Предупреждение осложнений состоит в тща­тельном сборе аллергоанамнеза и назначении препаратов в соответствии с индивидуальной чувствительностью пациента. Кроме того, антибиотики обладают некоторым иммунодепрессивным действием и могут способство­вать развитию вторичного иммунодефицита и ослаблению напряженности иммунитета.

^ Эндотоксический шок (терапевтический). Это явление, которое возникает при лече­нии инфекций, вызванных грамотрицательными бактериями. Введение антибиотиков вызывает гибель и разрушение клеток и вы­свобождение больших количеств эндотокси­на. Это закономерное явление, которое со­провождается временным ухудшением кли­нического состояния больного.

^ Взаимодействие с другими препаратами. Антибиотики могут способствовать потен­цированию действия или инактивации других препаратов (например, эритромицин стиму­лирует выработку ферментов печени, которые начинают ускоренно метаболизировать ле­карственные средства разного назначения).

Побочное воздействие на микроорганизмы.

Применение антимикробных химиопрепа-ратов оказывает на микробы не только прямое угнетающее или губительное воздействие, но также может привести к формированию ати­пичных форм микробов (например, к обра­зованию L-форм бактерий или изменению других свойств микробов, что значительно затрудняет диагностику инфекционных забо­леваний) и персистирующих форм микробов. Широкое использование антимикробных ле­карственных средств ведет также к форми­рованию антибиотикозависимости (редко) и лекарственной устойчивости — антибиотикорезистентности (достаточно часто).


44 Механизмы лекарственной устойчивости возбудителей инфекционных болезней. Пути ее преодоления.


Антибиотикорезистентность — это устойчи­вость микробов к антимикробным химиопрепаратам. Бактерии следует считать резистент­ными, если они не обезвреживаются такими концентрациями препарата, которые реально создаются в макроорганизме. Резистентность может быть природной и приобретенной.

^ Природная устойчивость. Некоторые виды микробов природно ус­тойчивы к определенным семействам антиби­отиков или в результате отсутствия соответс­твующей мишени (например, микоплазмы не имеют клеточной стенки, поэтому не чувстви­тельны ко всем препаратам, действующим на этом уровне), или в результате бактериальной непроницаемости для данного препарата (на­пример, грамотрицательные микробы менее проницаемы для крупномолекулярных соеди­нений, чем грамположительные бактерии, так как их наружная мембрана имеет «маленькие» поры).

^ Приобретенная устойчивость. Приобретение резистентности — это биологическая закономерность, связанная с адаптацией микроорганизмов к условиям внешней среды. Она, хотя и в разной степени, справедлива для всех бактерий и всех анти­биотиков. К химиопрепаратам адаптируются не только бактерии, но и остальные микро­бы — от эукариотических форм (простейшие, грибы) до вирусов. Проблема формирования и распространения лекарственной резистен­тности микробов особенно значима для внутрибольничных инфекций, вызываемых так называемыми «госпитальными штаммами», у которых, как правило, наблюдается множес­твенная устойчивость к антибиотикам (так называемая полирезистентность).

^ Генетические основы приобретенной резис­тентности. Устойчивость к антибиотикам определяется и поддерживается генами резистентности (r-генами) и условиями, способствующими их распространению в микробных популяциях. Приобретенная лекарственная устойчивость может возникать и распространяться в попу­ляции бактерий в результате:

мутаций в хромосоме бактериальной клетки с последующей селекцией (т. е. отбором) му­тантов. Особенно легко селекция происходит в присутствии антибиотиков, так как в этих условиях мутанты получают преимущество перед остальными клетками популяции, ко­торые чувствительны к препарату. Мутации возникают независимо от применения анти­биотика, т. е. сам препарат не влияет на час­тоту мутаций и не является их причиной, но служит фактором отбора. Далее резистентные клетки дают потомство и могут передаваться в организм следующего хозяина (человека или животного), формируя и распространяя ре­зистентные штаммы. Мутации могут быть: 1) единичные (если мутация произошла в одной клетке, в результате чего в ней синтезируются измененные белки) и 2) множественные (се­рия мутаций, в результате чего изменяется не один, а целый набор белков, например пени-циллинсвязывающих белков у пенициллин-резистентного пневмококка);

переноса трансмиссивных плазмид резис­тентности (R-плазмид). Плазмиды резистен­тности (трансмиссивные) обычно кодируют перекрестную устойчивость к нескольким семействам антибиотиков. Впервые такая множественная резистентность была описа­на японскими исследователями в отношении кишечных бактерий. Сейчас показано, что она встречается и у других групп бактерий. Некоторые плазмиды могут передаваться меж­ду бактериями разных видов, поэтому один и тот же ген резистентности можно встретить у бактерий, таксономически далеких друг от друга. Например, бета-лактамаза, кодируемая плазмидой ТЕМ-1, широко распространена у грамотрицательных бактерий и встречается у кишечной палочки и других кишечных бак­терий, а также у гонококка, резистентного к пенициллину, и гемофильной палочки, резис­тентной к ампициллину;

переноса транспозонов, несущих r-гены (или мигрирующих генетических последова­тельностей). Транспозоны могут мигрировать с хромосомы на плазмиду и обратно, а также с плазмиды на другую плазмиду. Таким образом гены резистентности могут передаваться да­лее дочерним клеткам или при рекомбинации другим бактериям-реципиентам.

^ Реализация приобретенной устойчивости. Изменения в геноме бактерий приводят к тому, что меняются и некоторые свойства бактериальной клетки, в результате чего она становится устойчивой к антибактериальным препаратам. Обычно антимикробный эффект препарата осуществляется таким образом: агент должен связаться с бактерией и прой­ти сквозь ее оболочку, затем он должен быть доставлен к месту действия, после чего пре­парат взаимодействует с внутриклеточными мишенями. Реализация приобретенной ле­карственной устойчивости возможна на каж­дом из следующих этапов:

модификация мишени. Фермент-мишень может быть так изменен, что его функции не нарушаются, но способность связываться с химиопрепаратом (аффинность) резко сни­жается или может быть включен «обходной путь» метаболизма, т. е. в клетке активируется другой фермент, который не подвержен дейс­твию данного препарата.

«недоступность» мишени за счет сниже­ния проницаемости клеточной стенки и кле­точных мембран или «эффлюко-механизма, когда клетка как бы «выталкивает» из себя антибиотик.

инактивация препарата бактериальными ферментами. Некоторые бактерии способны продуцировать особые ферменты, которые де­лают препараты неактивными (например, бета-лактамазы, аминогликозид-модифицирующие ферменты, хлорамфениколацетилтрансфераза). Бета-лактамазы — это ферменты, разруша­ющие бета-лактамное кольцо с образованием неактивных соединений. Гены, кодирующие эти ферменты, широко распространены среди бактерий и могут быть как в составе хромосо­мы, так и в составе плазмиды.

Для борьбы с инактивирующим действием бета-лактамаз используют вещества — ин­гибиторы (например, клавулановую кисло­ту, сульбактам, тазобактам). Эти вещества содержат в своем составе бета-лактамное кольцо и способны связываться с бета-лактамазами, предотвращая их разрушитель­ное действие на бета-лактамы. При этом собственная антибактериальная активность таких ингибиторов низкая. Клавулановая кислота ингибирует большинство известныхбета-лактамаз. Ее комбинируют с пеницил-линами: амоксициллином, тикарциллином, пиперациллином.

Предупредить развитие антибиотикорезистентности у бактерий практически не­возможно, но необходимо использовать антимикробные препараты таким образом, чтобы не способствовать развитию и рас­пространению устойчивости (в частности, применять антибиотики строго по показа­ниям, избегать их использования с профи­лактической целью, через 10—15 дней ан-тибиотикотерапии менять препарат, по воз­можности использовать препараты узкого спектра действия, ограниченно применять антибиотики в ветеринарии и не использо­вать их как фактор роста).


45 Методы определения чувствительности бактерий к антибиотикам.


Для определения чувствительности бак­терий к антибиотикам (антибиотикограммы) обычно применяют:

^ Метод диффузии в агар. На агаризованную питательную среду засевают исследуемый микроб, а затем вносят антибиотики. Обычно препараты вносят или в специальные лунки в агаре, или на поверхности посева раскла­дывают диски с антибиотиками («метод дис­ков»). Учет результатов проводят через сутки по наличию или отсутствию роста микробов вокруг лунок (дисков). Метод дисков — качес­твенный и позволяет оценить, чувствителен или устойчив микроб к препарату.

^ Методы определения минимальных ингибирующих и бактерицидных концентраций, т. е. минимального уровня антибиотика, кото­рый позволяет in vitro предотвратить видимый рост микробов в питательной среде или пол­ностью ее стерилизует. Это количественные методы, которые позволяют рассчитать дозу препарата, так как концентрация антибиоти­ка в крови должна быть значительно выше ми­нимальной ингибирующей концентрации для возбудителя инфекции. Введение адекватных доз препарата необходимо для эффективного лечения и профилактики формирования ус­тойчивых микробов.

Есть ускоренные способы, с применением автоматических анализаторов.

^ Определение чувствительности бактерий к антибиотикам методом дисков. Исследуемую бактериальную культуру засевают газоном на питательный агар или среду АГВ в чашке Петри.

Среда АГВ: сухой питательный рыбный бульон, агар-агар, натрий фосфат двузамещенный. Среду готовят из сухого порошка в соответствии с ин­струкцией.

На засеянную поверхность пинцетом помещают на одинако­вом расстоянии друг от друга бумажные диски, содержащие определенные дозы разных антибиотиков. Посевы инкубируют при 37 °С до следующего дня. По диаметру зон задержки роста исследуемой культуры бактерий судят о ее чув­ствительности к антибиотикам.

Для получения достоверных результатов необходимо приме­нять стандартные диски и питательные среды, для контроля которых используются эталонные штаммы соответствующих микроорганизмов. Метод дисков не дает надежных данных при определении чувствительности микроорганизмов к плохо диффундирующим в агар полипептидным антибиотикам (например, полимиксин, ристомицин). Если эти антибиотики предполагается использовать для лечения, рекомендуется определять чувстви­тельность микроорганизмов методом серийных разведений.

^ Определение чувствительности бактерий к антибиотикам методом серийных разведений. Данным методом определяют минимальную концентрацию антибиотика, ингибирующую рост исследуемой культуры бактерий. Вначале готовят основной раствор, содержащий определенную концентрацию антибиотика (мкг/мл или ЕД/мл) в специальном растворителе или буферном растворе. Из него готовят все последующие разведения в буль­оне (в объеме 1 мл), после чего к каждому разведению добав­ляют 0,1 мл исследуемой бактериальной суспензии, содержащей 106—107 бактериальных клеток в 1 мл. В последнюю пробирку вносят 1 мл бульона и 0,1 мл суспензии бактерий (контроль культуры). Посевы инкубируют при 37 °С до следующего дня, после чего отмечают результаты опыта по помутнению питатель­ной среды, сравнивая с контролем культуры. Последняя про­бирка с прозрачной питательной средой указывает на задержку роста исследуемой культуры бактерий под влиянием содержа­щейся в ней минимальной ингибирующей концентрации (МИК) антибиотика.

Оценку результатов определения чувствительности микро­организмов к антибиотикам проводят по специальной готовой таблице, которая содержит пограничные значения диаметров зон задержки роста для устойчивых, умеренно устойчивых и чувствительных штам­мов, а также значения МИК антибиотиков для устойчивых и чувствительных штаммов.

^ К чувствительным относятся штаммы микроорганизмов, рост которых подавляется при концентрациях препарата, обнаружи­ваемых в сыворотке крови больного при использовании обычных доз антибиотиков. К умеренно устойчивым относятся штаммы, для подавления роста которых требуются концентрации, созда­ющиеся в сыворотке крови при введении максимальных доз препарата. Устойчивыми являются микроорганизмы, рост кото­рых не подавляется препаратом в концентрациях, создаваемых в организме при использовании максимально допустимых доз.

^ Определение антибиотика в крови, моче и других жидкостях организма человека. В штатив устанавливают два ряда проби­рок. В одном из них готовят разведения эталонного антибиотика, в другом — исследуемой жидкости. Затем в каждую пробирку вносят взвесь тест-бактерий, приготовленную в среде Гисса с глюкозой. При определении в исследуемой жидкости пеницил­лина, тетрациклинов, эритромицина в качестве тест-бактерий используют стандартный штамм S. aureus, а при определении стрептомицина — Е. coli. После инкубирования посевов при 37 °С в течение 18—20 ч отмечают результаты опыта по помутнению среды и ее окрашиванию индикатором вследствие расщепления глюкозы тест-бактериями. Концентрация антибиотика опреде­ляется умножением наибольшего разведения исследуемой жид­кости, задерживающей рост тест-бактерий, на минимальную концентрацию эталонного антибиотика, задерживающего рост тех же тест-бактерий. Например, если максимальное разведение исследуемой жидкости, задерживающее рост тест-бактерий, рав­но 1 :1024, а минимальная концентрация эталонного антибио­тика, задерживающего рост тех же тест-бактерий, 0,313 мкг/мл, то произведение 1024- 0,313=320 мкг/мл составляет концен­трацию антибиотика в 1 мл.

^ Определение способности S. aureus продуцировать бета-лактамазу. В колбу с 0,5 мл суточной бульонной культуры стандарт­ного штамма стафилококка, чувствительного к пенициллину, вносят 20 мл расплавленного и охлажденного до 45 °С питатель­ного агара, перемешивают и выливают в чашку Петри. После застывания агара в центр чашки на поверхность среды поме­щают диск, содержащий пенициллин. По радиусам диска петлей засевают исследуемые культуры. Посевы инкубируют при 37 °С до следующего дня, после чего отмечают результаты опыта. О способности исследуемых бактерий продуцировать бета-лакта-мазу судят по наличию роста стандартного штамма стафило­кокка вокруг той или другой исследуемой культуры (вокруг диска).


46 Принципы рациональной антибиотикотерапии.


Профилактика развития осложнений со­стоит прежде всего в соблюдении принципов рациональной антибиотикотерапии (антимик­робной химиотерапии):

^ Микробиологический принцип. До назна­чения препарата следует установить возбу­дителя инфекции и определить его индиви­дуальную чувствительность к антимикроб­ным химиотерапевтическим препаратам. По результатам антибиотикограммы больному назначают препарат узкого спектра дейс­твия, обладающий наиболее выраженной активностью в отношении конкретного воз­будителя, в дозе, в 2—3 раза превышающей минимальную ингибирующую концентра­цию. Если возбудитель пока неизвестен, то обычно назначают препараты более широ­кого спектра, активные в отношении всех возможных микробов, наиболее часто вы­зывающих данную патологию. Коррекцию лечения проводят с учетом результатов бак­териологического исследования и опреде­ления индивидуальной чувствительности конкретного возбудителя (обычно через 2-3 дня). Начинать лечение инфекции нужно как можно раньше (во-первых, в начале за­болевания микробов в организме меньше, во-вторых, препараты активнее действуют на растущих и размножающихся микробов).

^ Фармакологический принцип. Учитывают особенности препарата — его фармакокинетику и фармакодинамику, распределение в организме, кратность введения, возможность сочетания препаратов и т. п. Дозы препаратов должны быть достаточными для того, чтобы обеспечить в биологических жидкостях и тка­нях микробостатические или микробоцидные концентрации. Необходимо представлять оп­тимальную продолжительность лечения, так как клиническое улучшение не является основанием для отмены препарата, потому что в организме могут сохраняться возбудители и может быть рецидив болезни. Учитывают также оптимальные пути введения препарата, так как многие антибиотики плохо всасываются из ЖКТ или не проникают через гематоэнцефалический барьер.

^ Клинический принцип. При назначении пре­парата учитывают, насколько безопасным он бу­дет для данного пациента, что зависит от ин­дивидуальных особенностей состояния больного (тяжесть инфекции, иммунный статус, пол, на­личие беременности, возраст, состояние функции печени и почек, сопутствующие заболевания и т.п.) При тяжелых, угрожающих жизни инфек-циях особое значение имеет своевременная ан-тибиотикотерапия. Таким пациентам назначают комбинации из двух-трех препаратов, чтобы обес­печить максимально широкий спектр действия. При назначении комбинации из нескольких пре­паратов следует знать, насколько эффективным против возбудителя и безопасным для пациента будет сочетание данных препаратов, т. е. чтобы не было антагонизма лекарственных средств в отно­шении антибактериальной активности и не было суммирования их токсических эффектов.

^ Эпидемиологический принцип. Выбор пре­парата, особенно для стационарного больно­го, должен учитывать состояние резистент­ности микробных штаммов, циркулирующих в данном отделении, стационаре и даже ре­гионе. Следует помнить, что антибиотикоре-зистентность может не только приобретаться, но и теряться, при этом восстанавливается природная чувствительность микроорганизма к препарату. Не изменяется только природная устойчивость.

^ Фармацевтический принцип. Необходимо учитывать срок годности и соблюдать правила хранения препарата, так как при нарушении этих правил антибиотик может не только по­терять свою активность, но и стать токсич­ным за счет деградации. Немаловажна также и стоимость препарата.


47 Понятие об инфекции. Условия возникновения инфекцион­ного процесса.

Конструктор сайтов - uCoz